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酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和保存

更新時(shí)間:2019-05-17  |  點(diǎn)擊率:807

        酵母,如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母,通常用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物,他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物具有很好的相似性,所以是的生物模型。

        酵母細(xì)胞用于研究基因功能,蛋白質(zhì)相互作用,細(xì)胞通路等,也是大規(guī)模異源蛋白表達(dá)和小分子生產(chǎn)的宿主,在發(fā)酵,釀造和制藥行業(yè)等起著*的作用。涉及酵母的常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)有酵母雙/三雜交系統(tǒng),突變體篩選庫(kù)和同源重組,等等。

        一、為什么我們需要酵母感受態(tài)細(xì)胞?

        通常,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需外源DNA引入到酵母細(xì)胞。引入基因片段(線性ssDNA或質(zhì)粒)是通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的,具體方法有化學(xué)法,如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細(xì)胞為開(kāi)始。勝任力則是指細(xì)胞能吸收游離的細(xì)胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。

        二、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 

        獲得感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)簡(jiǎn)單,但許多研究人員在實(shí)現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時(shí)  遇到問(wèn)題。常見(jiàn)的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細(xì)胞死亡率,或由于無(wú)效的感受態(tài)細(xì)胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。

        雖然酵母細(xì)胞和大腸桿菌一樣容易生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化,但它們需要不同的處理方法來(lái)制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣,有類(lèi)似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細(xì)胞制備協(xié)議如下:

  1. 過(guò)夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株,使用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細(xì)胞。對(duì)于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細(xì)胞,使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來(lái)維持質(zhì)粒。
  2. 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 - 2 x 107cells/mL,離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞密度可以通過(guò)使用分光光度計(jì)在OD600檢測(cè),或者使用血球計(jì)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
  3. 沖洗細(xì)胞,重懸于無(wú)菌水,離心,棄上清,重復(fù)此步驟兩次以*清洗細(xì)胞。
  4. MAX后一次洗完,將細(xì)胞重懸于感受態(tài)細(xì)胞溶液,分裝,大約每管108個(gè)細(xì)胞,每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細(xì)胞。分裝好的管子放于-80°C,供以后實(shí)驗(yàn)使用。
  5. 在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無(wú)菌過(guò)濾器消毒過(guò)的試劑,以防止污染問(wèn)題。

        感受態(tài)細(xì)胞溶液包含合適濃度的冷凍保護(hù)劑,這些濃度應(yīng)該在你的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化,根據(jù)使用的酵母菌株和細(xì)胞的濃度。標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,這種配方被廣泛應(yīng)用來(lái)制備感受它細(xì)胞,也可根據(jù)具體情況進(jìn)行輕微的改變或調(diào)整。

        關(guān)于冷凍保護(hù)劑

        甘油和二甲亞砜(DMSO)是MAX常見(jiàn)的細(xì)胞可透過(guò)性冷凍保護(hù)劑,用于準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞。它們穿透細(xì)胞,防止冰晶的形成,冰晶可能會(huì)在凍結(jié)過(guò)程中導(dǎo)致膜破裂。甘油和DMSO也有一定的缺點(diǎn),他們可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性,特別是在解凍過(guò)程中。非細(xì)胞透過(guò)性的試劑如蔗糖和海藻糖等也可用于替代物。山梨糖醇鈣也是一個(gè)好的冷凍保護(hù)劑,尤其適用于電穿孔制備感受態(tài)細(xì)胞。

        三、酵母感受態(tài)細(xì)胞的儲(chǔ)存

        每次轉(zhuǎn)化時(shí)使用新鮮的感受態(tài)細(xì)胞是明智的,因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存,轉(zhuǎn)化效率會(huì)降低,但這并不總是可行的。

        感受態(tài)細(xì)胞可以存儲(chǔ)在-80°C長(zhǎng)達(dá)一年,沒(méi)有轉(zhuǎn)化潛能的損失。然而, 瞬間凍結(jié)在液氮或-80°C冰箱是不建議的。感受態(tài)細(xì)胞需要在冷凍保護(hù)劑中,像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣緩慢地冷凍。

  1. 使用硬紙板或聚苯乙烯泡沫塑料盒等儲(chǔ)存。
  2. 用紙片等將盒子里的細(xì)胞管隔開(kāi),分成多個(gè)小格子。
  3. 復(fù)蘇過(guò)程中,在電熱恒溫培養(yǎng)箱37°C解凍細(xì)胞,轉(zhuǎn)化前用豐富培養(yǎng)基清洗防凍劑。
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