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大腸桿菌的常見(jiàn)檢測(cè)方法

更新時(shí)間:2019-06-06  |  點(diǎn)擊率:1203

  大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名,而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求,提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌,這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非*一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn),可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌(俗稱大腸桿菌)、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。
  MPN檢索表:MPN 為MAX大可能數(shù)(Most Probable Nwww.atcc360.comumber)的簡(jiǎn)稱。這種方法,對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋,加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率,用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)MAX近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度,如改用不同的稀釋度,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。
  初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn):
  1)兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同,但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義,即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系,氯化鈉可維持滲透壓,月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng),這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵(Slow lactose fermentations)”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。
  2)初發(fā)酵陽(yáng)性管,不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌,經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后,有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明,食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率,初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此,在實(shí)際檢測(cè)工作中,證實(shí)試驗(yàn)是必需的。
  產(chǎn)氣量與倒管:
  在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中,經(jīng)??梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡(有時(shí)比小米粒還?。?,有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明,大腸菌群的產(chǎn)氣量,多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí),可以用手輕輕打動(dòng)試管,如有氣泡沿管壁上浮,即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生,而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。
  大腸桿菌為兩端鈍圓的短小桿菌,一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm,多單獨(dú)存在或成雙,但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛,但多數(shù)只有1-4根,一般不超過(guò)10根,故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛,有的有莢膜或微莢膜,不形成芽孢,對(duì)普通堿性染料著色良好,革蘭氏染色陰性。
  大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng),在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。MAX適生長(zhǎng)溫度為37℃可用電熱恒溫培養(yǎng)箱營(yíng)造合適的生長(zhǎng)環(huán)境,在42-44 ℃條件下仍能生長(zhǎng),生長(zhǎng)溫度范圍15-46 ℃。
  在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài):
  1)光滑型:菌落邊緣整齊,表面有光澤、濕潤(rùn)、
  光滑、呈灰色,在生理鹽水中易分散;
  2)粗糙型:菌落扁平、干澀、邊緣不整齊,易
  在生理鹽水中自凝;
  3)黏液型:常為含有莢膜的菌株
  檢樣50g+450ml稀釋液,適當(dāng)十倍稀釋樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液,
    每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯(每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管),每管接種1mL,如沒(méi)有產(chǎn)氣,則報(bào)告為陰性;如有產(chǎn)氣,則分別接種BGLB肉湯管(35 ± ℃ ,48 ± 2h)和EC肉湯(44.5±0.5 ℃ (水浴培養(yǎng))24 ± 2h ~48 ± 2h ),對(duì)于接種BGLB肉湯管的查MPN表報(bào)告結(jié)果,驗(yàn)證是否為大腸菌群;對(duì)于接種EC肉湯的產(chǎn)氣管接種EMB平板(35℃、18~24h)從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜面,進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復(fù)檢產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告結(jié)果驗(yàn)證是否為大腸桿菌。

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